前言

HCP ELISA檢測方法必須要通過(guò)法規認可的實(shí)驗方法（ICH或FDA指南等）進(jìn)行方法學(xué)驗證，以確保其能夠產(chǎn)生準確的結果。想要獲得準確的HCP ELISA檢測結果，本質(zhì)上是要保證樣品中HCP的濃度高于試劑盒的定量下限（LOQ），同時(shí)HCP的檢測抗體還要處于過(guò)剩狀態(tài)，滿(mǎn)足這兩點(diǎn)就必須要對檢測樣品（過(guò)程樣品和最終的藥物原液）進(jìn)行稀釋線(xiàn)性驗證。因此，稀釋線(xiàn)性（dilution linearity）是驗證HCP ELISA方法特異性和準確性的關(guān)鍵實(shí)驗之一。在HCP檢測中，稀釋線(xiàn)性不佳的原因主要有兩種：一種是樣品中某些HCPs的抗體過(guò)剩條件不滿(mǎn)足，需要通過(guò)進(jìn)一步稀釋來(lái)達到“最小必要稀釋倍數”（MRD）；另一種是產(chǎn)品蛋白本身或產(chǎn)品配方緩沖液中的某些成分對HCP的檢測產(chǎn)生干擾，可以采用指定的樣品稀釋液（見(jiàn)文末）或者緩沖液置換等方式處理樣品來(lái)滿(mǎn)足檢測需求。關(guān)于樣品稀釋液，最優(yōu)的選擇是使用和標準品相同的稀釋液。Cygnus針對每種ELISA檢測方法都提供了相應的樣品稀釋液，以確保檢測結果的準確性和可重復性。對于使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的用戶(hù)，我們建議將可接受的稀釋線(xiàn)性定義為“在兩倍稀釋時(shí)，校正后的HCP濃度變化不超過(guò)±20%”。同時(shí)，還要避免檢測值靠近定量下限，即稀釋樣品HCP檢測值不能低于定量下限的兩倍。接下來(lái)，本文將為您詳細解讀HCP ELISA方法學(xué)驗證中有關(guān)線(xiàn)性稀釋的操作方法與注意事項。

為什么要建立稀釋線(xiàn)性？

在測試一個(gè)新的宿主細胞蛋白（HCP）ELISA方法時(shí)，建立稀釋線(xiàn)性是第一項基礎實(shí)驗，目的是確認所選擇的HCP ELISA是否適用于您的過(guò)程樣品和藥物原液中的HCPs。當稀釋線(xiàn)性確認后，它將為進(jìn)一步的分析驗證提供所需的實(shí)驗條件信息，因此稀釋線(xiàn)性通常是最先進(jìn)行的驗證實(shí)驗。

具體來(lái)講，稀釋線(xiàn)性實(shí)驗的目的是確定ELISA方法對樣品中HCPs的反應曲線(xiàn)和全定量范圍。成功驗證了稀釋線(xiàn)性意味著(zhù)對存在于該樣品中的各種HCPs，抗體過(guò)剩條件已滿(mǎn)足，且樣品基質(zhì)不會(huì )影響HCP的定量，從而保證HCP ELISA檢測結果的可靠性。

如何進(jìn)行稀釋線(xiàn)性實(shí)驗？

在進(jìn)行ELISA分析之前，任何可能超過(guò)定量上限（ULOQ）的樣品都應該先進(jìn)行稀釋線(xiàn)性實(shí)驗。其過(guò)程包括：用驗證過(guò)的樣品稀釋液對HCP待檢樣品進(jìn)行多個(gè)梯度稀釋?zhuān)?/span>然后對這些稀釋樣品進(jìn)行檢測，并計算每個(gè)稀釋樣品中校正后的HCP濃度（即測得的HCP濃度×稀釋倍數）。大多數情況下，在達到一定稀釋倍數后，稀釋樣品校正后的HCP濃度值會(huì )出現相對恒定狀態(tài)，那么該稀釋倍數則被稱(chēng)為“最低需求稀釋度”（MRD）。

圖1 最低需求稀釋度（MRD）

如下表案例，樣品在高濃度（未稀釋和1:2，1:4稀釋）時(shí)并未顯示出良好的稀釋線(xiàn)性，但隨著(zhù)進(jìn)一步稀釋?zhuān)?/span>我們可以確定一個(gè)MRD，即在此稀釋度實(shí)現了可接受的稀釋線(xiàn)性（見(jiàn)下表藍色行）。按照定義，當校正后的HCP濃度在2倍稀釋之間的變化范圍不超過(guò)±20%時(shí)，即達到了可接受的稀釋線(xiàn)性，同時(shí)還要避免靠近定量下限，即稀釋樣品HCP檢測值不能低于定量下限的兩倍（在這個(gè)案例中1:64稀釋樣品HCP檢測值＜2倍LOQ，因此未計入統計）。變化百分比可以通過(guò)減去前一稀釋樣品濃度的校正值，然后將差值再除以前一個(gè)稀釋樣品濃度的校正值來(lái)計算。例如，1:2稀釋樣品相較未稀釋樣品的變化百分比為：[(233-146)/146]x100%=60%。

從表中數據我們可以得出結論，該樣品的MRD為1:4，那么最終計算出HCP的濃度應在MRD以下（或等于）和LOQ以上所有校正后HCP濃度的平均值（在此例中，應取312、361、356和370的平均值即350ng/mL）。

在實(shí)際應用中，我們應當對需要檢測HCP的所有樣品類(lèi)型（包括過(guò)程樣品以及最終的藥物原液）進(jìn)行稀釋線(xiàn)性的評估，并將每種樣品類(lèi)型和基質(zhì)的MRD值以及稀釋不同樣品的具體指導納入到SOP文件中。

稀釋線(xiàn)性不佳的原因與解決方法

對于HCP ELISA檢測，可能會(huì )出現某些HCPs稀釋線(xiàn)性不佳的情況，也就是樣品中存在某些HCPs的抗體過(guò)剩條件未被滿(mǎn)足。例如，個(gè)別高濃度的HCP可能對該特定HCP的抗體產(chǎn)生飽和，出現了“鉤子效應（high-dose hook effect）”，從而導致該HCP的定量不準確。

圖2 鉤子效應（high-dose hook effect）示意圖

此外，某些伴隨蛋白（hitchhiker proteins）可能會(huì )與產(chǎn)物蛋白相互作用，并在純化過(guò)程中顯著(zhù)富集，從而完全干擾整個(gè)分析的線(xiàn)性。

圖3. 伴隨蛋白（hitchhiker proteins）與產(chǎn)物蛋白相互作用干擾分析線(xiàn)性

其他導致稀釋線(xiàn)性不佳的原因還有可能是產(chǎn)品配方（或過(guò)程樣品的緩沖溶液）中的某些成分干擾了檢測，對于Cygnus HCP ELISA試劑盒，已知的干擾因素包括極端pH、洗滌劑、有機溶劑、高蛋白濃度和高鹽濃度等，因此我們建議樣品的稀釋一定要使用和標準品相同的稀釋液，詳見(jiàn)下表。

Cygnus不同生物工藝雜質(zhì)檢測試劑盒對應的樣品稀釋液一覽

最后，我們再次強調，只有在抗體過(guò)剩的情況下，劑量反應曲線(xiàn)才會(huì )呈正斜率，檢測結果才是準確的。

如果稀釋線(xiàn)性不佳的因素是由HCP抗體不足或樣品基質(zhì)干擾，那么隨著(zhù)樣品的稀釋倍數增加，其測得的HCP濃度會(huì )呈現上升趨勢，因此需要通過(guò)進(jìn)一步稀釋樣品來(lái)達到MRD。如果是其他原因，也可以通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗步驟來(lái)提高檢測的準確性。如果增加樣品的稀釋倍數仍無(wú)法解決稀釋線(xiàn)性不佳的問(wèn)題，則有可能是純化過(guò)程存在問(wèn)題。

Cygnus針對每一種檢測試劑盒均提供相應的QS（Qualification Summary）文件，如有需求歡迎點(diǎn)擊這里填寫(xiě)信息索取，或者聯(lián)系Cygnus中國總代理西美杰。如果您在Cygnus HCP ELISA試劑盒的使用中遇到了稀釋線(xiàn)性相關(guān)問(wèn)題且無(wú)法通過(guò)上述方法解決的，也歡迎您隨時(shí)聯(lián)系西美杰，我們的技術(shù)支持會(huì )針對您的問(wèn)題提供相應解決方法和建議。接下來(lái)我們還會(huì )陸續分享一系列關(guān)于HCP ELISA方法學(xué)驗證的內容，包括加標回收以及HCP抗體適用性驗證等，敬請關(guān)注。

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